自然杀伤(NK)细胞在肿瘤治疗中被认为相较于T细胞更加安全可靠。针对CD19靶点的嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞已被证明在淋巴B细胞肿瘤患者的治疗中安全有效。然而，CAR-NK细胞的制作过程复杂且成本高昂。因此，本研究应用了一种非基因改造技术“别针”(Pin)技术，旨在生产抗肿瘤NK细胞。该方法利用脐血来源的单个核细胞(PBMCs)与细胞因子IL-2和IL-15以及转染了爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)的B淋巴母细胞滋养层细胞来培养NK细胞，并使用改良过的抗CD20和抗CD19抗体进行孵育扩增。这种改良抗体在CD16a上的亲和力增强，从而使得NK细胞在表面附带抗CD19/CD20抗体，以利用抗体依赖性细胞毒性增强对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤，达到与CAR-NK细胞相似的治疗效果。

在别针单抗的生产和纯化中，人类IgG1的Fc CH2结构域上进行了四个氨基酸的替换：S239D、H268F、S324T和I332E。所有别针抗体均由位于法国贝桑松的RD-Biotech生产，使用CHO细胞合成并经过蛋白A纯化。所有别针单抗的序列均来自于已在临床中使用的单抗，其中别针-CD20的抗原结合域来源于利妥昔单抗，别针-HER2的来源于曲妥珠单抗，别针-EGFR的来源于西妥昔单抗，而别针-CD19的来源则是布纳吐莫单抗。

细胞方面，K562、Daudi、Toledo、Raji、MOLM-13、Namalwa、Ramos、Karpas、TDM8、SUDHL-10、SUDHL-6和SUDHL-4等细胞系均购自ATCC或ECACC，所有悬浮细胞在含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中培养。HCT116、MDA-MB-468、MCF7则在含10% FBS的DMEM高糖培养基中培养。淋巴瘤细胞患者样本来自蒙彼利埃CHU的CRB-CHUM平台。

抗体定量细胞系和患者样本中CD19与CD20的绝对值采用BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒，结合BDFACSCantoII流式细胞仪进行检测。NK细胞的体外扩增采用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒II，从脐血单个核细胞中去除CD3阳性细胞，随后培养剩余细胞于含10% FBS的RPMI-1640或5%人类血清的培养基中，并额外添加IL-2和IL-15。培养保持至Day5至Day7，定期更换新鲜培养基，确保NK细胞密度维持在0.6×10^6细胞/mL以上，最终培养时间持续14至20天。随后，经过EBV转染的B淋巴母细胞将按适当比例添加至培养体系中。

在体外扩增结束后，收集2×10^5个扩增后的NK(eNK)进行流式细胞术检测，分析CD56、CD45、CD57等标志物的表达情况。eNK细胞的武装使用Muse细胞分析仪进行计数，再将2×10^6个细胞/mL的eNK重悬于含有10μg/mL别针-CD20/CD19/EGFR/HER2单抗的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中，在37℃下孵育1小时。部分实验中，别针单抗会提前用荧光染料标记以供后续实验使用。在细胞毒性检测中，eNK或别针单抗eNK与CFSE标记的靶细胞混合，以特定E:T比在96孔板中共培养24小时，利用流式细胞术检测靶细胞的杀伤程度。

在体内细胞毒性实验中，NSG小鼠购买自IGMM，10周龄的雌性NSG小鼠将分别腹腔注射别针注射的eNK、别针CD20-eNK和别针CD19-eNK，同时注入荧光标记的Nalm6细胞及Raji细胞或Daudi细胞。在注射4小时后，处死小鼠并收集腹水细胞，经去除红细胞后，对腹水细胞进行流式细胞术分析，检测eNK细胞的存活与细胞毒性能力。

在小鼠体内白血病模型中，将2×10^5个Raji细胞静脉注射至CB17SCID小鼠体内。在肿瘤细胞注射后第4天和第8天，腹腔注射30×10^6个eNK或别针-CD20eNK细胞，作为对照组的小鼠注射纯PBS。在第11、14、17天进行静脉注射IL-15，最终在第27天处死小鼠并收集肺、骨髓和血液样本，分析Raji细胞在各组织中的占比。

在体内和体外研究中，eNK与别针-CD20单抗能够有效结合，通过对脐血来源单个核细胞进行IL-2/IL-15的刺激，在该培养方案下成功获得了具有完整细胞毒性和高纯度(CD56+CD3-细胞＞95%)的eNK。通过对单抗的改造形成别针单抗，增强了其对CD16a的亲和力，以武装eNK，并最终生成了别针单抗eNK。根据实验方案，80%的eNK能够成功结合别针单抗，而不同的利妥昔单抗未能维持与eNK的结合。在SCID小鼠腹腔注射别针-CD20eNK后，注射后24小时仍有80%的eNK存在于体内。

在体外对B淋巴细胞系的实验中，别针-CD20eNK展现出别针单抗依赖性细胞毒性，特别在高CD20和低CD20表达细胞株的E:T比测试中，别针-CD20eNK表现出更强的细胞毒性。优化抗体浓度后，发现40μg/mL的别针单抗对eNK的杀伤效果最佳。同时，双重别针武装的eNK有效增强了对CD19和CD20阳性靶细胞的选择性杀伤。该研究表明，通过精准改造抗体与eNK的结合，可以有效清除B细胞，相比传统方法具备了更强的治疗潜力。

鸿运国际一直致力于推动生物医疗领域的创新，未来将继续探索更多针对肿瘤治疗的新方法，期望能为患者提供更加安全有效的治疗选择。